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谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒說明書

注意：正式測(cè)定之前選擇預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 22mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 2 mL 蒸餾水溶解。

產(chǎn)品說明：

微量法

GST 是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。GST 是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與 GSH 的巰基共價(jià)結(jié)合，使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì)，易于從膽汁或尿液中排泄，達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此，GST 在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外，因?yàn)?GST 具有 GSH-Px 活性，亦稱為 non-Se GSH-Px，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如 DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意，GST 催化的反應(yīng)減少 GSH 含量，但是不增加 GSSG 含量。

GST 催化 GSH 與 CDNB 結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長(zhǎng)為 340nm；通過測(cè)定 340nm 波長(zhǎng)處吸光度上升速率，即可計(jì)算出 GST 活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外-可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔

UV 板和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL

試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3 .血清等液體：直接測(cè)定。二、測(cè)定：

1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，用蒸餾水調(diào)零。

2.試劑二放在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）保溫。

3.空白管：取微量石英比色皿，加入 20μL 試劑一，180μL 試劑二和 20μL 試劑三，迅速混勻后于

340nm 測(cè)定 10 s 吸光度記 A1，37℃水浴 5min 后，快速取出測(cè)定吸光度記 A2。

4.測(cè)定管：取微量石英比色皿，加入 20μL 上清液，180μL 試劑二和 20μL 試劑三，迅速混勻后于

340nm 測(cè)定 10 s 吸光度記 A3，37℃水浴 5min 后，快速取出測(cè)定吸光度記 A4。三、GST 活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。

GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷Cpr

2.按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。

GST（U/g 鮮重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷W

3.按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST（U/104 cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷500

4.按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST（U/mL）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷V 樣÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103 L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；106：1mol=1×106μmol；V 反總：反應(yīng)體系總體積，220μL=2.2×10-4  L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量，g；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V 樣總：試劑一體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5min；500：細(xì)胞數(shù)量， 500 萬。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。

GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

=0.38×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。

GST（U/g 鮮重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=0.38×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST（U/104 cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.38×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷500

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST（U/mL）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷V 樣÷T

=0.38×[(A4－A3)－(A2-A1)]

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103 L/mol /cm；d：96 孔板光徑，0.6cm；106：1mol=1×106μmol；V 反總：反應(yīng)體系總體積，220μL=2.2×10-4  L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V 樣總：加入試劑一體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5min；500：細(xì)胞數(shù)量，500 萬。

注意事項(xiàng)：

1.樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；

2.細(xì)胞中 GST 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中 GST 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；

3.測(cè)定前先用 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如 5min 內(nèi)反應(yīng)不成線性，須對(duì)樣品用蒸餾水稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

4.若樣品測(cè)定吸光度大于 1，建議對(duì)樣品用蒸餾水稀釋，計(jì)算時(shí)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

5.測(cè)定反映的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，請(qǐng)控制在 25℃或者 37℃（哺乳動(dòng)物）。

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